Las garrapatas Rhipicephalus (Boophilus) microplus representan un problema fuerte en los sistemas de producción bovina en el trópico húmedo mexicano. Para su control se aplican varios productos químicos con implicaciones negativas como bioresistencia, altos costos, impacto ambiental y riesgos en la salud de las personas que consumen leche y carne que pueden contener residuos . El objetivo de esta investigación fue evaluar la patogenicidad in vitro de las cepas MM0801 y CD0804 de Metarhizium anisopliae sobre garrapatas Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Se evaluaron cinco concentraciones 3x104, 3x105, 3x106, 3x107, 2.6x108 de conidios/ml de M. anisopliae sobre garrapatas en estado adulto recolectadas vivas de bovino de la cuenca lechera de Catazajá, Chiapas, México. Las garrapatas fueron susceptibles al hongo entomopatógeno encontrando una mortalidad del 50 % donde la Concentración Letal Media obtenida fue de 6.58 x 106 conidios/ml de la cepa MM0801. Se concluye que M. anisopliae influye en el grado de virulencia de la garrapata, lo cual puede ser una alternativa de control biológico de la garrapata en el trópico húmedo mexicano.

La garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus es el ectoparásito de mayor implicación económica en los sistemas de producción de ganado bovino en zonas tropicales y subtropicales del mundo (Ojeda-Chi et al., 2011). Estos parásitos hematófagos son causantes de trasmisión de enfermedades como la Babesia bovis, B. bigemina y Anaplasma marginale, además de ocasionar daños a la piel y disminución en la producción de carne, leche (Baruch, 2012). Para su control químicos se invierten más 2500 millones de dólares anualmente a nivel global (Lew-Tabor et al., 2014). Además los productos químicos tienen otras limitantes como son: el impacto ambiental, bioresisntecia de algunas poblaciones y riesgos en la salud de las personas por el consumo de carne y lácteos con residuos de químicos. En México se han registrado 82 especies de garrapatas tanto en animales silvestres como domésticos. La dinámica poblacional de Rhipicephalus (Boophilus) microplus en los estados de Chiapas y Tabasco se presenta durante todo el año, donde las medidas de control consisten en aplicaciones de acaricidas químicos dirigidos a la fase adulta, lo cual implica muchas limitantes económicas, ambientales y seguridad alimentaria. Los medios para el control de la garrapata son diversos ixodicidas como los arsenicales, organoclorados, organofosforados, carbamatos, formamidas, piretroides sintéticos (flumetrina), lactonas acrocíclicas (eprinomectina), fenilpirazoles (fipronil), así como algunos reguladores del crecimiento como los análogos de la hormona juvenil (metopreno y fenoxicarb) y los inhibidores de la síntesis de quitina, como el fluazurón, diflubenzurón, lufenurón y la ciromazina (Cordero et al., 1999; Cuore et al., 2008 y Rodríguez et al., 2010 citados por Bautista et al (2017). La mayoría de estos ixodicidas han sido utilizados con buenos resultados en el control de las garrapatas; sin embargo, su uso continuo e irracional ha generado cepas resistentes, así como incremento en los costos de producción, como ha ocurrido en la región de la Cuenca Lechera de Catazajá (CLC), Chiapas y Tabasco, (Monroy et al., 2016). Debido a la demanda de alimentos libres de residuos químicos y el cuidado del ambiente, surge la necesidad de buscar alternativas no químicas para control de garrapatas. Por tanto, el objetivo de este estudio fue evaluar la capacidad patógena de dos cepas de Metarhizium anisopliae en garrapatas bajo condiciones de laboratorio; obteniendo resultados que puedan ser extrapolados a campo.

El proyecto de investigación se llevó a cabo en elLaboratorio de Biotecnología de la Facultad Maya de Estudios Agropecuarios dela Universidad Autónoma de Chiapas, localizado en el km 4, carretera Catazajá -Palenque, Chiapas, con coordenadas de 17°40’39.77” N y 92°01’34.18” O. Estas regionesse caracterizan por presentar clima cálido-húmedo con lluvias de mayo a diciembre,una precipitación pluvial de 2322 milímetros al año y la temperatura fluctúaentre los 22º C a 36º C, siendo 24.5º C la temperatura media anual.

Las cepas de M. anisopliae identificadas como MM0801 yCD0804 obtenidas a partir de aislados de moscas pintas (Aeneolamia postica) de la caña de azúcar (Saccharum spp.) y larvasde polilla de la cera (Gallería melonella).Ambas cepas de M. anisopliae fueron reactivadassobre broca del café (Hypothenemus hampei).

a) Recolecta de broca de café adultos (H. hampei). Primero se recolectaron en áreas cafetaleras del sur de Chiapas, los insectos fueron colocados en cajas de Petri estériles, para poder trasladarlos al laboratorio donde se desinfectaron por inmersión en hipoclorito de sodio al 0.5 % durante 5 min, después se lavaron tres veces con abundante agua destilada estéril, colocándose en gasas estériles para eliminar el exceso de humedad y posteriormente dejarlos en cajas Petri estériles.

b) Inoculación de Metarhizium. Las brocas del café se inocularon por inmersión durante 1 minutos en 100 ml con la suspensión del hongo M. anisopliae a una concentración de 1x108 conidios/ml, posteriormente se colocaron en cajas Petri con papel filtro esterilizado húmedo para facilitar el desarrollo del hongo sobre el insecto. Después de ocho días, el hongo se desarrolló completamente en el cuerpo de H. hampei, las cuales se colocaron en cajas Petri con medio de cultivo PDA (papa dextrosa agar) usando 39 g en 1 L de agua y esterilizado en autoclave a 121 °C a 15 libras de presión durante 15 minutos.

c) Colecta de garrapatas adultas. Las garrapatas fueron colectadas de bovinos infestados de ranchos ganaderos de la cuenca lechera de Catazajá, Chiapas. Se recolectaron en promedio de 1000 adultas, de las cuales se seleccionaron al azar 60 garrapatas por concentración utilizando un total de 420.

d) Determinar la ConcentraciónLetal Media (CL-50). Para la evaluación dela patogenicidad in vitro de la cepaMM0801 y CD0804 de M. anisopliae engarrapatas adultas, se empleó un diseño experimental completamente al azar con seisrepeticiones, cada replica con 10 garrapatas adultas (60 garrapatas por tratamiento),los resultados fueron analizados con un ANOVA y Tukey (P≤0.05). Lostratamientos consistieron en evaluar las dos cepas de M. anisopliae (MM0801 yCD0804) en concentraciones de 3 x104, 3 x105, 3 x106,3 x107, 2.6x108 esporas/ mililitro de cada cepa, éstascomparadas con un testigo absoluto que consistió en agua destilada estéril conTween 80® y un testigo relativo con Amitraz®(N''-metilbis(2,4-xililimino-metilamina) (Cuadro 1), producto químico comúnmente utilizadopor los ganaderos para el control de la garrapata. Para realizar el conteo deesporas y establecer la línea de concentraciones de esporas por tratamiento, serealizó una solución de esporas, se pasó al conteo de conidios en la cámara deNeubauer (Goetell e Inglis, 1997), donde se obtuvo una concentración desolución madre de 2.6 x 108 conidios/ ml y a partir de estaconcentración obtenida, se realizó las diluciones de esporas en Abdeherente ADE más Tween 80 al 0.03 %.

e) Índice de virulencia.Se evaluó la mortalidadde garrapatas cada 24 horas después de la inoculación, que consistió en sumergirlas garrapatas en la solución de esporas por un minuto. Se contaron lasgarrapatas muertas y fueron expuestas en cámara húmeda, posteriormente setomaron datos de virulencia. La cámara húmeda consistió en cajas de Petri estérilescon algodón húmedo y fueron selladas con Parafilm.

f) Capacidad de germinación.Se evaluó la capacidadgerminativa de las cepas MM0801 y CD0804, el procedimiento consistió eninocular alícuotas de 5 µl en cajas Petri con 10 ml de medio de cultivo PDA. Semarcó la cara posterior externa de las cajas Petri con 7 puntoscorrespondientes a los lugares donde se depositaron las alícuotas;posteriormente, se incubaron durante 36 horas a temperatura ambiente (30±2),tiempo después del cual se adicionó una gota de azul de lacto fenol con el finde suspender el proceso de germinación y teñir las esporas. Los puntos deinoculación se contaron en cuadrados, se transfirieron a laminas portaobjetos yse cubrió con una laminilla para proceder al recuento. La observaciónmicroscópica se realizó con un aumento de 40X, determinando la germinación encinco campos microscópicos/alícuota, totalizando las esporas germinadas y nogerminadas; los resultados se expresaron en porcentaje de esporas germinadaspor repetición, para cada cepa se utilizaron cinco cajas Petri por repetición.

g) Viabilidad de las esporas. Se prepararon cajas Petri de 60 mm de diámetro con medio de cultivo Agar Dextrosa Sabouraud (ADS), agregando de 12 a 15 ml del medio de cultivo; Se preparó una suspensión de esporas de 2.6X108conidios/ml agitándose hasta obtener una suspensión homogénea; Posteriormente se realizaron diluciones, tomando 1 ml de la solución de esporas y fue colocado en un frasco con 9 ml Tween 20 al 0.03 %; agregando 50 µl de la solución de esporas en cinco puntos de la caja de Petri con ADS. Se incubó la caja Petri previamente inoculada con el hongo a 27 ± 1 °C por 12 a 24 h; Consecutivamente se observó al microscopio óptico en el objetivo 40X, agregando una gota de lactofenol azul con un algodón para detener el desarrollo de los conidios y contar 300 conidios, registrando las esporas germinadas y no germinadas; el criterio a considerar un conidio como germinado es que su tubo germinativo sea igual o mayor que el tamaño del conidio (Alatorre, 2009). Se contó un total de 8 cajas por aislamiento dando un total 16 cajas evaluadas; Posteriormente se realizó un promedio y se calculó el porcentaje de germinación.

Se tomaron fragmentosdel hongo M. anisopliae que tenían uncrecimiento de ocho días en medio de cultivo PDA. El tamaño del fragmento fuede 0.5 X 0.5 cm y estos aislamientos fueron colocados en el centro de la caja Petricon medidas de 15 x 60 mm. El material se incubo a temperatura ambiente (30°C) yse midió el crecimiento radial con un calibre Vernier cada 24 horas a partir dela inoculación. El diámetro de la colonia se expresó en milímetros. Para laevaluación de esta variable, se usó un diseño completamente aleatorio con cincorepeticiones para cada cepa, dando un total de 10 cajas Petri.

La determinación de lascaracterísticas morfológicas como color, aspecto de la colonia, formación de cinemas,producción y difusión de pigmento de las cepas seleccionadas se basó en laobservación macroscópica de las colonias. El procedimiento consistió eninocular alícuotas de 5 µl en el centro de 10 cajas Petri con 10 ml de PDA sinacidificar, incubando a temperatura ambiente por 30 días.

Enla reactivación de Metarhizium anisopliaedela cepa MM0801 y CD0804 sobre la broca de café Hypothenemus hampei cinco días post inoculación se obtuvoresultados de esporulación del hongo en el cuerpo del insecto, con un 80% degerminación.

Lasdos cepas de Metarhizium anisopliae MM0801 y CD0804 dela región, fueron reactivadas en broca de café (Hypothenemus hampei), las cepas presentaron crecimiento a los 8 díasde haber inoculado en medios de cultivo PDA (Agar Dextrosa Papa).

Los resultados que se obtuvieron en la toma de datos del experimento de la determinación de CL50 para conocer la virulencia del hongo Metarhizium anisopliae sobre la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus fueron analizados con Probit. La determinación de la CL50 fue calculada con una solución de 2.6 x108 de la cepa MM0801 y de la CD0804 con una solución de 5.28 x 108, en la figura 1 se observa garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus micosada con las dosis obtenidas del hongo Metarhizium anisopliae en esta investigación.

Enel cuadro 2 se observa los datos de mortalidad encontrada, corregida y esperadade las cepas MM0801 y CD0804 sobre Rhipicephalus(Boophilus) microplus, estosindican que la segunda cepa mencionada fue la que obtuvo mejores resultados. Porotro lado, la Concentración Letal Media (CL50) para la cepa MM0801de Metarhizium anisopliae fue de6.58X106 conidios/ml mientras que para la cepa CD0804 fue de 8.87X105conidios/ml, en ambos casos se evaluaron los datos a los siete días post-inoculación,con intervalos de confianza del 95%. Se menciona que la cepa CD0804 obtuvomejor resultado debido a que a menor concentración se logra alcanzar su CL50a diferencia con la cepa MM0801 que fue a mayor concentración para encontrar suCL50, posiblemente esto se deba a la caracterización genética quepresenta cada cepa como lo menciono Bautista et al., 2012, lo cual no coincide como se ha descrito en otroestudio que determinaron un CL50 con una concentración de 106y 108 conidios/ml, siendo esta mayor a la se obtuvo en el presenteestudio Melo et al.,( 2006).

Bazán(2002), evaluó el hongo Beauveria bassianay encontró un porcentaje de mortalidad a los siete días de 82.5 % con una concentraciónde 3200 ppm, siendo mayor en comparación con el presente estudio, posiblementese puede atribuir a las condiciones del hongo y las concentraciones que seutilizaron. Por lo que se recomienda evaluar a Beauveria bassiana en la región de los Ríos del estado de Tabasco. La diferencia de los resultados obtenidos en laConcentración Letal Media probablemente se deba al tipo de insecto hospederodonde fue aislado, la distribucióngeográfica de las cepas o lasvariaciones genéticas.

Se encontró que la cepaMM0801 presenta una germinación 87.84% a las 18 horas en comparación a la cepaCD0801 que tuvo una germinación del 74.56%, mientras que a las 24 horas seobservó que la cepa MM0801 presenta un 100% de germinación en comparación conla cepa CD0804 que presento un 80.54%. En otros estudios por Bautista-Galvez etal., (2012), obtuvieron un porcentaje de germinación de conidios del 92% dela cepa MM0801 a las 24 horas en comparación con este trabajo que se obtuvo un100% de germinación, posiblemente se deba a que esta cepa fue reactivada (figura2).

En la figura 3 Se observa que el crecimiento radial en medio decultivo con PDA para la cepa MM0801 fuede 0.62 cm a las 48 horas en comparación a la cepa CD0804 que tuvo uncrecimiento de 0.78 cm. Por lo que ladiferencia entre cepa fue de 0.1 cm. Elósegui et al., (2003),evaluaron crecimiento radial de cepas de Metarhiziumanisopliae en medio de cultivo ADS, encontrando diferencias significativas fluctuandoentre 31 y 37 mm en comparación a este trabajo que vario muy poco, estosautores evaluaron crecimiento radial de hongos entomopatógenos y no mostrarondiferencia significativa entre las cepas con el medio ADS.

Se muestra que la diferencia entre cepa fue de 0.2 cm. En comparación al trabajo de Ruiz-Sánchez et al., (2011), que evaluaron crecimiento radial obteniendo resultados que variaron de 0.31 a 0.37 cm. Sin embargo, la cepa MM0801 en las primeras 96 horas mostro un crecimiento lento con un promedio de crecimiento por día de 1.4 cm, esta diferencia numérica no impacto en las pruebas de virulencia ya que la cepa MM0801 fue la más agresiva.

En cuanto a la caracterización morfológica y el color de las cepas de Metarhizium anisopliae en el medio de cultivo ADS (Agar Dextrosa Sabouraud) a los tres días de haberse inoculado, presentaron una coloración rosada de acuerdo con García Gutiérrez et al, (2006) esto posiblemente se deba al contenido de metabolitos extracelulares y actividad enzimática que se lleva a cabo durante el desarrollo del micelio. Sin embargo, estas cepas al momento de inocular presentaron una coloración para la cepa MM0801 verde oscuro y para la cepa CD0804 presento una coloración oliva-amarillo, esto coincide a Bautista-Galvez et al., (2012).

Metarhiziumanisopliaeinfecta las poblaciones de garrapatas Rhipicephalus(Boophilus) microplus conlas cepas MM0801 con una CL50 de 6.48X106 conidios/ml yCD0804 con una CL50 de 8.87X105conidios/ml. Elcrecimiento radial de las cepas MM0801 y CD0804 de Metarhizium anisopliae con el medio de cultivo PDA mostraron uncrecimiento similar para ambas cepas. La viabilidad de conidios con la cepaMM0801 influyó en el grado de virulencia de un 30.45% y con la cepa CD0804 un34.45% en la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus.

Agradecimiento a laFacultad Maya de Estudios Agropecuarios de la Universidad Autónoma de Chiapaspor su apoyo brindado en la elaboración de este proyecto, a la FundaciónProduce Tabasco por el financiamiento otorgado para la ejecución del presente trabajoy agradecemos profundamente a los productores ganaderos de la Cuenca Lechera dela región de Catazajá por la facilitación de sus potreros y animales para elmuestreo de la garrapata. Al Cuerpo Académico: Biodiversidad y DesarrolloSustentable UNACH-159 por el acompañamiento a salidas a campo.